流式细胞DNA分析

　　流式细胞仪并非是完全自动化的仪器，准确的实验结果还需要准确的人工技术配合，所以标本制备需要规范，仪器本身亦需要质量控制。

　　(一) 流式细胞术免疫学检测的影响因素和质量控制

　　流式细胞术在免疫学中有着广泛的应用，其免疫荧光染色的标本制备非常重要，常常由于标本制备过程中出现人为非特异性荧光干扰(尤其在间接免疫荧光染色中)或细胞浓度低等影响检测结果。解决这些影响因素的方法如下：

　　(1) 确保标本上机检测前的浓度为1X106细胞/ml，细胞浓度过低直接影响检测结果。

　　(2) 使用蛋白封闭剂，封闭非特异结合位点，尤其在间接免疫荧光标记时必不可少。常用的蛋白封闭剂为0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。

　　(3) 荧光抗体染色后充分洗涤，注意混匀和离心速度，减少重叠细胞和细胞碎片。

　　(4) 设置对照样品，采用与抗体来源同型匹配的无关对照和荧光抗体的本底对照。

　　(5) 判定结果时，应注意减去本底荧光，为使免疫荧光的定量分析更精确，应用计算机程序软件，用拟合曲线方法从实验组的曲线峰值中减去对照组的曲线峰值，可以得到更准确的免疫荧光定量结果。

　　(6) 注意染色后避光，保证细胞免疫荧光的稳定。

　　(二) DNA 倍体分析的质量控制仍没有统一的标准，各文献报道的实验结果差异较大，1993年10月美国癌症研究组织制定了FCMDNA 测定的统一标准，我们根据这些标准并结合国内有经验的专家多年的实践，对FCM的DNA分析技术的质控和注意事项进行说明。

　　(1) 手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时，要避免出血坏死组织。

　　(2) 标本采集后要及时固定或深低温保存，以免组织发生自溶，DNA 降解，而造成测试结果的误差。

　　(3) 固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度，70%的乙醇固定效果较好。

　　(4) 单细胞悬液制备过程中，注意将待测细胞成分分离出来，减少其他成分的干扰，并注意不要损伤该群细胞。

　　(5) 细胞样品的采集要保证足够的细胞浓度，即1X106细胞/ml，杂质、碎片、团块和重叠细胞应<2%，对肿瘤细胞DNA异倍体的分析样品，至少有20%的肿瘤细胞存在。

　　(6) 石蜡包埋组织单细胞制备时要注意：取材时应选取无自溶、坏死的组织，对肿瘤组织标本，选取含肿瘤细胞丰富的区域;石蜡组织片的厚度要适宜，最好为40～50μm 。过薄或过厚的切片均会影响检测结果;彻底脱蜡，以免残留的石蜡影响酶的消化活性，验证脱蜡是否完全的方法是弃去二甲苯，加入100%乙醇，如果无絮状物浮起，说明蜡已脱净;水化要充分，使组织还原到与新鲜组织相似的状态;注意消化的时间和消化酶的活性。常规使用0.5%胃蛋白酶，pH 1.5。

　　(三) 操作方面

　　(1) 流式细胞仪在整个工作过程中处于最佳状态，能保证定量检测的准确性和检测精度。使用标准样品调整仪器的变异系数在最小范围，分辨率在最好状态，能避免在测量过程中仪器条件的变化引起的检测误差。

　　(2) 评价仪器精度的重要指标是仪器的变异系数(CV)，对于校准样品，其CV值越小越好，CV值越小，说明仪器校正的精度越高。校准样品包括非生物样品(荧光微球)和生物细胞样品(人淋巴细胞、鸡红细胞等) 。目前，非生物荧光微球已有商品试剂，CV一般<2%～3%。

　　(四) 资料分析方面

　　(1) 当样品中碎片杂质或团块过多，所测细胞数在20%以下，组方图的基线抬高时，应放弃分析处理。

　　(2) 做细胞周期分析时，样品细胞数应在1万个，排除碎片、杂质和团块，当异倍体细胞数占总细胞数10%以下时，需要结合其他诊断指标，不可盲目下结论，至少异倍体细胞占总细胞数的20%以上，可以确定异倍体的存在。

　　(3) DNA分析时，正常二倍体细胞组方图CV值>8%时放弃分析，但肿瘤细胞的CV值>8%，与肿瘤细胞的异质性有关。另外，DNA倍体分析时，同源组织的不同个体会出现10 %的漂移。

　　(4 )DNA倍体标准的质量控制，采用相同个体同源正常组织、同样固定方法、相同的样品处理方法、相同的染色方法、同步染色、同样的仪器检测条件、正常的二倍体组织作为内标准。

流式细胞DNA分析是可以研究间期细胞，并不受细胞增殖状态的影响，对检测胸腔积液中的恶性细胞的有重要意义的一种检查方法。

1.备齐用物，标本容器上贴好标签，核对无误后向患者解释以取得合作。露出患者手臂，选择静脉，于静脉穿刺部位上方约4～6cm处扎紧止血带，并嘱患者握紧拳头，使静脉充盈显露。　

2.常规消毒皮肤，待干。　　

3.在穿刺部位下方，以左手拇指拉紧皮肤并固定静脉，右手持注射器，针头斜面向上与皮肤成15度～30度，在静脉上或旁侧刺入皮下，再沿静脉走向潜行刺入静脉，见回血后将针头略放平，稍前行固定不动，抽血至需要量时，放松止血带，嘱患者松拳，干棉签按压穿刺点，迅速拔出针头，并将患者前臂屈曲压迫片刻。　　

4.卸下针头，将血液沿管壁缓缓注入容器内，切勿将泡沫注入，以免溶血。容器内放有玻璃珠时应迅速摇动，以除去纤维蛋白原;如系抗凝试管，应在双手内旋转搓动，以防凝固;如系干燥试管，不应摇动;如系液体培养基，应使血液与培养液混匀，并在血液注入培养瓶前后，用火焰消毒瓶口，注意勿使瓶塞接触血液。　　

5.送实验室检查